Риботипирование штаммов Corynebacterium diphtheriae, выделенных в России.

Риботипирование штаммов Corynebacterium diphtheriae, выделенных в России.

 

Комбарова С.Ю., Мельников В.Г., Борисова О.Ю., Костюкова Н.Н., Мазурова И.К. Московский НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н.Габричевского М3 РФ, НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи РАМН

Одной из задач микробиологического мониторинга дифтерийной инфекции является изучение структуры популяции Corynebacterium diphtheriae в динамике эпидемического процесса с целью раскрытия механизмов формирования и распространения эпидемических штаммов возбудителя дифтерии, а также его сохранения в межэпидемический период.

Современные молекулярно-генетические методы внутривидового типирования микроорганизмов - возбудителей инфекционных заболеваний, такие как мультилокусный энзимный электрофорез, риботипирование, пульсэлектрофорез, ПЦР с универсальными праймерами (RAPD), SSCP-типирование позволяют выявлять эпидемически значимые штаммы н наблюдать за их распространением.

В результате наблюдения за штаммами C.diphtheriae в течение длительного времени и сопоставления различных систем типирования (маркирования) были показаны широкие возможности метода риботипирования. Метод основан на объединение штаммов в группы (риботипы) по признаку общности генов рРШС которые являются универсальными генетическими маркерами, т.к. не изменяются в процессе эволюции. Вследствие этого данный метод может быть применен для типирования практически всех C.diphtheriae, независимо от территории и времени их выделения.

Настоящая работа посвящена изучению штаммов С diphtheriae, циркулирующих в России в различные периоды эпидемического процесса.

Материалы и методы.

Изучено 467 токсичных штаммов C.diphtheriae (88 биовара mitis и 379 биовара gravis), выделенных от больных дифтерией и бактерионосителей на территории России (г.г. Москва, Санкт-Петербург, Владимирская, Липецкая, Пензенская, Калининградская, Мурманская, Ленинградская, Челябинская, Омская, Магаданская области. Краснодарский, Красноярский, Приморский края. Чукотский автономный округ).

Риботипирование осуществляли в соответствии с методикой (1).

Результаты и обсуждение.

В течение многолетних наблюдений (18 лет) за генетической структурой токсигенных штаммов C.diphtheriae зарегистрировано 19 риботипов. Анализ встречаемости риботипов в каждом году наблюдения показал, что удельный вес различных риботипов был непостоянным в изучаемый промежуток времени, который включал: 1) период высокой заболеваемости дифтерией до введения в 1958 г. планомерной массовой иммунизации детей и спада заболеваемости на фоне массовой иммунизации (1945, 1950, 1963, 1967, 1971 г.г.); 2) период спорадической заболеваемости (1985-1989 г.г.), однако известно, что в 1983-1985 г.г. наблюдалась активизация эпидемического процесса при сравнительно невысоких показателях заболеваемости; 3) период второю эпидемического подъема и спада заболеваемости в условиях массовой иммунизации детой (1990-1997 г.г.).

Во время последнего эпидемического подъема (1990-1994 г.г.) на территории России выявлено 15 риботипов (Ml, M1v, МЗ, М6, М9, M11, М13, G1, G4, G4v, G3, G6, G1, MNT1, MNT2). Вместе с тем, доминировали штаммы C.diphtheriae биовара gravis двух близкородственных риботипов G1 и G4. Повышение удельного веса штаммов риботипов G1 и G4 (41,1%) было обнаружено в 1987-1989 г.г. до повышения показателей заболеваемости (ПЗ на 100000 населения 0.4 - 0,5) (2). Во время пика эпидемического подъема в 1994 г., когда ПЗ (26.9) был равен таковому, зарегистрированному в 1960 г., удельный вес риботипов G1 и G4 увеличился до 70 0 %. Кроме риботипов G1 и G4 в 1994 г было отмечено еще 6 риботипов: Ml, Mlv, MNT1, MNT2, G3, G6.

При стабилизации ПЗ в 1995 г. (24.1) и снижении ПЗ в 1996 - 1997 г.г.(9.2 и 2.6 соответственно) популяция C.diphtheriae стала еще более однородной: удельный вес доминирующих риботипов продолжал увеличиваться и составила 95,3%, 96.1% и 87,0% соответственно. Среди других риботипов в 1995-1996 г.г. отмечено только два близкородственных риботипа Ml и М1v, в то время как в 1997 г. при некоторой тенденции к снижению удельного веса, а доминирующих риботипов зарегистрировано 4 других риботипа: Ml, Mlv, G4v, Ml5, причем риботип Ml5 в предыдущие годы не встречался. Вероятно, доминирование риботипов G1 и G4 будет наблюдаться до тех пор пока, у населения не сформируется антибактериальный иммунитет, который будет способствовать ограничению циркуляции данных риботипов.

Штаммы C.diphtheriae риботипов G1 и G4 были обнаружены во всех регионах России, что позволило отнести данные штаммы к эпидемическим. Повсеместному распространению эпидемических штаммов способствовали миграция населения, приток беженцев с территорий, неблагополучных по дифтерийной инфекции, перемещение воинских контингентов из Средней Азии и Афганистана.

Таким образом, при активизации эпидемического процесса дифтерийной инфекции происходила направленная перестройка генетической структуры популяции C.diphtheriae. Подъем заболеваемости сопровождался селекцией генетически однородных штаммов, которая началась до повышения показателей заболеваемости (1986-1989 г.г.). Вместе с тем, несмотря на снижение интенсивности эпидемического процесса, в 1995-1997 г.г. популяция продолжала оставаться гомогенной.

Сохранение однородной генетической структуры популяции явление закономерное, обусловленное широким распространением эпидемических штаммов возбудителя дифтерии, Для подтверждения высказанного предположения были изучены штаммы, циркулировавшие в годы высокой заболеваемости и постепенного ее снижения при введении планомерной массовой иммунизации детей.

Показатели гели заболеваемости в годы, предшествующие началу введения массовой иммунизации составили в 1946 г. - 41.0, в 1950 г. - 53,7, в 1958 г. - 68,0 . В последующие годы наблюдались высокие темпы снижения заболеваемости и уже к 1965 г. ПЗ был равен 2,1. Начало 70-х годов характеризовалось спорадической заболеваемостью, когда регистрировались единичные случаи заболевания (ПЗ 0,29-0,03).

Токсигенные C.diphtheriae, выделенные в 1945, 1950, 1963, 1967 и 1971 г.г. принадлежали к биовару gravis и риботипу M11, т.е. были генетически однородными. К началу наших исследований были известны серотипы 11 из 20 изученных культур, причем 7 культур (63,6%) относились к серотипу 2. Из данных литературы известно, что в прошлые годы большинство, токсигенных C.diphtheriae, выделенных на территории России принадлежали к серотипу 2 . Учитывая этот факт, а также случайный характер выборки штаммов и длительность периода наблюдения, можно утверждать, что риботип M1l был доминирующим в 40-70-е годы. Важно отметить, что этот риботип по классификации Института Пастора (Париж) имеет обозначение C.d.3=Lionl и включает штаммы C.diphtheriae биовара gravis. Штаммы этого риботипа встречались в России, Западной Европе и Америке.

В 80-е годы (1985-1989) произошло изменение структуры популяции C.diphtheriae. На фоне спорадического уровня заболеваемости выявлено 11 риботипов (Ml, Mlv, МЗ, М4, М5, М6, M8, M11, М13, G4v, 04). В течение этого периода в 1985 г. наблюдалось некоторая интенсификация эпидемического процесса (ПЗ 0,8), когда доминировали штаммы биовара mitis близкородственных риботипов Ml и Mlv (57,1 %). В 1986 - 1989 доля риботипов Ml и Mlv составила 31,4%. Необходимо отметить, что только 7,3% штаммов принадлежали к риботипу M11 (C.d3=Lionl), однако в эту группу входили штаммы как биовара gravis, так и mitis. В 90-е годы риботип M11 не регистрировали.

Таким образом, анализ данных риботипирования C.diphtheriae, выделенных в различные периоды эпидемического процесса дифтерийной инфекции показал, что для каждого эпидемического цикла характерно преимущественное распространение штаммов определенной генетической структуры. В 40-70-е годы эпидемические C.diphtheriae представляли штаммы биовара gravis риботипа M11 (C.d.3=Lionl), в 80-е годы - штаммы биовара mitis близкородственных риботипов М1 и Mlv, в 90-с годы - штаммы биовара gravis близкородственных риботипов G1 и G4.

В последнее время в связи с эпидемией дифтерии в России в 90-х годах случаи заболевания дифтерией в странах Западной Европы и в Америке часто связывают с завозом инфекции из России. Однако обнаружение одинаковых риботипов без установления эпидемиологических связей не может быть доказательством случаев завоза инфекции. Исследования показали, что даже в странах с высоким уровнем жизни сохраняется циркуляция возбудителя дифтерии и возможны вспышки заболевания и носительства, обусловленные местными штаммами (4). В 1996 г. в Американском Индейском сообществе в Южной Дакоте был выявлен очаг дифтерийной инфекции. При сопоставлении результатов молекулярного типирования культур из этого очага и музейных штаммов, собранных в Южной Дакоте в 1973-1980 г.г., установлено, что большинство культур вспышки 1996 г. и музейные штаммы принадлежали к одной клональной группе по данным мультилокусного энзимного электрофореза и к риботипам, родственным M11 (M11 M11b, M11d), что свидетельствует о существовании источника инфекции в Южной Дакоте и длительной персистенции возбудителя дифтерийной инфекции на территории США.

Таким образом, методы молекулярного титрования являются весьма информативными при изучении процесса формирования популяции C.diphtheriae как на территории России, так и других стран в условиях различной интенсивности эпидемического процесса.

Выводы

1. Генетическая структура популяции C.diphtheriae непостоянна в динамике эпидемического процесса дифтерийной инфекции.
2. При активизации эпидемического процесса популяция C.diphtheriae приобретает гомогенную структуру, которая сохраняется длительное время при снижении интенсивности эпидемического процесса.
3. Для каждого эпидемического подъема заболеваемости характерно распространение эпидемических штаммов определенного биовара и риботипа. Процесс формирования эпидемических штаммов начинается до повышения заболеваемости дифтерией.
4. Данные микробиологического мониторинга могут быть использованы при составлении прогноза развития эпидемического процесса дифтерийной инфекции.

Литература

1. Комбарова С.Ю., Мельников В.Г., Борисова О.Ю., Popovic Т. Характеристика штаммов C.diphtheriae, циркулирующих в различные периоды эпидемического процесса дифтерийной инфекции//Вакцинопрофилактпке - 200 лет: Сб. научн.трудов МНИИЭМ им.Г.Н.Габричевского. - 1997. - С.27-32. 2. Инфекционные заболевания в России. Статистический справочник. - М., 1992. 3. Крылова М.Д. Дифтерийная инфекция. - М.: Медицина. 1976. 4. Popovic Т., Kim Ch., Reiss 1, Reeves M, Nakao H., Golaz A. Use of the molecular subtyping to document long-term persistence of C.diphtheriae in South Dakota// J.Clin.Microb. - 1999. - V.37.-P.1092-1099.